2024-01-13 16:02:07
Productos químicos y materiales.
El nitrato de plata y el sulfato de cobre (calidad analítica) se obtuvieron de Sigma Aldrich Bangalore, India. Todos los componentes de los medios bacteriológicos, como cristal violeta, triptona, extracto de levadura, glucosa y cloruro de sodio, y los medios, como los nutrientes, se adquirieron de Hi-Media Laboratories Pvt. Limitado. Ltd., Bombay, India. Las líneas celulares HeLa y HEK293 utilizadas en el experimento se adquirieron de American Type Culture Collection (ATTC, LG Promochem, Barcelona, España).
Preparación del extracto de la planta Aerva lanata.
La planta Aerva lanata se obtuvo del jardín de hierbas y vivero I-AIM en Bengaluru, India, siguiendo las pautas y regulaciones pertinentes establecidas por CHRIST (Considerada Universidad). Para garantizar la reproducibilidad del estudio, el comprobante que representa el espécimen se depositó en el herbario del Departamento de Ciencias de la Vida de Cristo (considerado Universidad) y se le asigna el número de identificación CULS_AS_001. El material vegetal recolectado, que representa la planta completa, se lavó con agua desionizada bidestilada y posteriormente se secó a la sombra durante un período de 5 días a temperatura ambiente. A continuación, las plantas secas se cortaron finamente y se pulverizaron en trozos grandes. Para preparar el extracto, se hirvieron 5 g del polvo de la planta entera con 100 ml de agua desionizada bidestilada a 70 °C durante 20 min. Esta solución se filtró adicionalmente usando papel de filtro Whatman No.1 y se centrifugó a 6000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se almacenó a 4 °C para uso experimental.
Síntesis de NP bimetálicas Ag-Cu
Caracterización
Figura 1
Representación esquemática del estudio.
Determinación de la concentración mínima inhibidora y mínima bactericida (MIC y MBC)
La MIC y MBC de las NP de Ag-Cu se probaron contra Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, y los resultados se registraron según las pautas del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. El ensayo se realizó diluyendo la concentración de NPs con caldo LB estéril para finalmente obtener series de concentraciones (15, 30, 60, 120, 240 μg mL-1) inoculadas con S. aureus y P. aeruginosa ajustadas a la turbidez de 5 × 105 UFC/mL. Estos caldos incubados se incubaron en una incubadora con agitación mantenida a 37 °C durante 24 h. La concentración a la que no había densidad celular ni turbidez se registró como MIC22. Después de la medición de la CIM de Ag-Cu NP, se tomaron alícuotas de 30 μl de los tubos que se colocaron en placas de agar MH y se incubaron durante la noche a 37 °C durante la noche. Se informó que la concentración más baja de NP que informó la muerte bacteriana fue el valor de MBC.
Ensayo de difusión bien
Se adoptó la técnica de difusión en pozo de agar para estudiar la actividad antimicrobiana de las NP Ag-Cu. Este ensayo se realizó con dos especies bacterianas S. aureus y P. aeruginosa. Se extendieron cultivos bacterianos revividos en fase logarítmica media en placas sobre agar Muller Hinton. Seguido de la perforación de los pocillos en el medio solidificado utilizando un perforador de gel que dio como resultado pocillos con un diámetro de 5 mm. En condiciones asépticas, los pocillos se cargaron con diferentes concentraciones de NP Ag-Cu de 15, 30, 60, 120 μg mL-1 y ampicilina de control positivo. Luego, la placa de cultivo cargada con la muestra se incubó a 37 °C durante la noche para observar y registrar la zona de aclaramiento en las placas y se midió el diámetro de las zonas23.
Efecto de las NP Ag-Cu sobre la formación de biopelículas.
Ensayo de formación de biopelículas.
El organismo de prueba en caldo LB se inoculó y se dejó crecer hasta alcanzar una turbidez constante de 0,5 estándares de McFarland (5 × 105 UFC/mL). Se agregaron diferentes concentraciones (15, 30, 60, 120, 240 μg mL-1) de NP Ag-Cu a tubos separados que contenían la suspensión bacteriana y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. También se mantuvo un control negativo sin la adición de NP. Después de la incubación, se retiró el medio y los tubos se lavaron tres veces con solución salina tampón fosfato (PBS, pH 7,2). Posteriormente, los tubos se tiñeron con colorante violeta cristal al 0,1% durante 30 min. El exceso de tinte se lavó con agua desionizada y los tubos se secaron a temperatura ambiente. La formación de biopelículas se evaluó observando la presencia de una fina película azul en las paredes de los tubos24.
Para estimar cuantitativamente la eficacia de las NP Ag-Cu para inhibir la formación de biopelículas, se utilizó un método propuesto por Kalishwaralal et al. se empleó utilizando una placa de microtitulación de 96 pocillos25. Brevemente, se agregaron 10 µl de cultivo cultivado y diluido (1:100) durante la noche a pocillos estériles que contenían 180 µl de caldo LB. Luego se agregaron NP Ag-Cu en concentraciones de 15, 30, 60, 120, 240 μg mL-1. Después de la incubación a 37 °C durante 24 h, se descartó el caldo LB y los pocillos se lavaron tres veces con solución salina tampón fosfato (PBS, pH 7,2) para eliminar las células no unidas. La biopelícula adherida a las paredes de los pocillos se fijó con acetato de sodio al 2% p/v y se tiñó con tinte violeta cristal al 0,1% durante 10 minutos. Las células teñidas se lavaron con agua desionizada bidestilada estéril y la tinción de cristal violeta en la superficie de la biopelícula se solubilizó agregando ácido acético al 30% e incubando a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. El cristal violeta solubilizado se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 570 nm (DO 570) usando un lector de placas ELISA. El porcentaje de inhibición de biopelículas se calculó utilizando la fórmula proporcionada:
$$text{Inhibición (%) = }frac{left(left({text{OD}}_{text{control}}text{ – }{text{OD}}_{ text{tratado}}right)right)}{{text{OD}}_{text{control}}} , times text{100 .}$$
(1)
Efecto de las NP Ag-Cu sobre la producción de sustancia polimérica extracelular (EPS)
La influencia inhibidora de las NP de Ag-Cu en la producción de EPS se analizó cuantitativamente en un ensayo ligeramente modificado26. Se inoculó asépticamente un cultivo nocturno de P. aeruginosa y S. aureus en 50 ml de caldo LB estéril y cada uno de estos cultivos se sometió a diferentes concentraciones de CMI subinhibitorias de NP (15, 30, 60, 120, 240 μg ml-1). y uno sin NP se mantuvo como control negativo. Todos los tubos se incubaron a 37 °C durante 24 h en una incubadora con agitador a 140 rpm. Después del período de incubación, las muestras de control y tratadas se centrifugaron a 6000 rpm durante 15 minutos a 4 °C y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante obtenido se trató con el doble de volúmenes de etanol helado seguido de refrigeración a 4 °C para facilitar la precipitación del EPS. Esta precipitación se separó y se concentró mediante centrifugación a 6000 rpm durante 20 min a 4 °C. El sedimento obtenido se utilizó para la cuantificación midiendo los carbohidratos utilizando el método de la antrona27. El porcentaje de inhibición de EPS se calculó utilizando la ecuación. (1).
Análisis de la actividad antioxidante de las NP bimetálicas Ag-Cu sintetizadas.
Ensayo de poder reductor
El poder reductor de las NP se determinó según el método de Alavi y Karimi con algunas modificaciones28. Las concentraciones de NP bimetálicas de 15, 30, 60, 120, 240 μg mL-1 se prepararon utilizando 0,2 M de tampón fosfato de pH 6,4. Las alícuotas se mezclaron con 2,5 ml de una concentración de 10 ml–1 de ferricianuro de potasio y se incubaron a 50 °C durante 30 min. Después de la incubación, se agregaron 2,5 ml de una concentración de 100 ml-1 de ácido tricloroacético y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 12 min. El sobrenadante se mezcló con un volumen igual de agua destilada (3 ml), se agregaron 0,6 ml de una concentración de 1,0 ml de cloruro férrico. Con BHT como configuración de control, se leyó la absorbancia de la solución a 700 nm. Los resultados indican que cuanto mayor es la absorbancia, mayor es su poder reductor.
Ensayo de eliminación de peróxido de hidrógeno.
El ensayo de eliminación de peróxido de hidrógeno se realizó modificando los métodos de Vilas et al.29, con ácido ascórbico como control, se dividieron en alícuotas varias concentraciones de NP bimetálicas (15, 30, 60, 120, 240 μg mL-1) y se agregaron con 100 l de solución de peróxido de hidrógeno 3 mM. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 30 min y se midió la absorbancia a 610 nm. El porcentaje de eliminación se calculó utilizando la ecuación. (1).
Ensayo de citotoxicidadEnsayo MTT para probar la viabilidad celular
análisis estadístico
Los experimentos se realizaron por triplicado y se analizaron mediante la prueba t de Student y ANOVA de dos factores, con significación estadística definida como valores de p <0,01, utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software Tools, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).
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